Microscópio
INTRODUÇÃO
O nome microscópio (mikrós, pequeno, e
skoppéoo, observar, ver através de) se deve a Jean Faber, membro da antiga
Academia dos Lincei (1624)). Este termo
designa um microscópio composto por uma objetiva e uma ocular, embora na
prática tenha sido estendido a todos os instrumentos ampliadores simples e
compostos.
O microscópio é um instrumento que
permite observar os objetos não perceptíveis à vista desarmada. Isso se consegue mediante um sistema óptico
composto por lentes de cristal que atravessadas pela imagem do objeto
ampliam-na. Segundo o número e a
posição das lentes, distinguem-se o microscópio simples (lupa = microscópio
estereoscópio) e o microscópio composto.
Denominamos microscópio simples a toda e
qualquer lente que com ou sem montagem própria, grande ou pequena, biconvexa ou
planoconvexa, amplia os objetos. É
comumente chamado de lupa. Existem
numerosos modelos e variedades.
Podemos dizer que qualquer lente
convergente utilizada de maneira que produza uma imagem virtual, e portanto,
direta, e maior que o objeto é um microscópio simples. As lupas somente se diferenciam na
montagem. Seu manejo é muito simples, e
consiste praticamente em orientar a lente de modo que sua face plana ou menos
curva fique voltada para o objeto e colocá-la a uma distância tal que este ( o
objeto ) fique situado entre o foco e o vértice e tanto mais próximo daquela
quanto maior se queira a imagem.
O microscópio composto é constituído pela
combinação de dois sistemas de lentes
convergentes: um próximo do olho do
observador, motivo pelo qual é chamado sistema de oculares, e que age como
microscópio simples; outro, próximo do objeto denominado sistema de
objetivas. Este é o verdadeiro
microscópio, que estamos acostumados a ver em todos os laboratórios.
Com os modelos simples é possível obter bons aumentos e realizar
excelentes observações pois, salvo para estudos muito especializados, que
requerem grandes aumentos, um microscópio comum nos será suficiente para passar
horas muito agradáveis e nos permitirá observar qualquer classe de
materiais. Salientemos que, por muitas
e variadas que sejam suas lentes, qualquer que seja sua potência, o princípio é
sempre o mesmo: é suficiente colocar a objetiva de modo que o objeto fique
colocado um pouco além do foco principal da lente, mas o mais próximo possível
dele, para que a imagem formada seja real e a maior possível ( imagem
intermediária).
Dispondo a ocular de maneira que a
imagem real obtida pela objetiva fique situada entre o vértice e o foco da
ocular, obter-se-á uma imagem virtual
direta e maior do que a primeira.
Observar-se-á pois, uma imagem do objeto virtual invertida e sumamente
aumentada.
Quanto maiores forem as curvaturas das
lentes e a distâncias entre o sistema de objetivas e o sistema de oculares
maior será o aumento total.
Vimos, por conseguinte, que o
microscópio composto possui dois sistemas de ampliação, o de oculares e o de
objetivas. Para calcular o aumento
total de um microscópio teremos, pois, que multiplicar o aumento próprio da
objetiva pelo aumento da ocular.
MICROSCÓPIOS ÓPTICOS E ELETRÔNICOS
MICROSCÓPIO ÓPTICO
O microscópio
óptico compõe-se de uma parte mecânica, que serve de suporte, e uma parte
óptica. Os seus componentes são:
1.
Ocular 9. Parafusos
macrométrico e
2.
Objetiva
micrométrico
3.
Diafragma do
condensador 10.
Charriot
4.
Dispositivo para centrar
a imagem 11. Seleção de filtros
do diafragma 12. Platina com lâmina
5.
Diafragma de Campo 13. Pé ou base
6.
Regulagem do
condensador 14. Braço ou estativo
7. Interruptor 15. Revólver
8. Regulagem da intensidade
luminosa
Ocular: é
uma lupa. As mais simples possui no seu interior duas lentes e um diafragma. No
interior da ocular temos então: lente de campo, diafragma e a ocular
propriamente dita.
Objetivas: são
formadas internamente por várias lentes. As resoluções alcançadas e a maior
parte da qualidade da imagem final dependem das lentes objetivas.
Há vários tipos de objetivas,
que se diferenciam pela qualidade da imagem, correção de aberração e
preço.
·
Tipos de objetivas:
1.
Acromáticas – são a mais simples. São aquelas sem nenhuma
sofisticação, que os microscópios comuns possuem.
2.
Semi-apocromática
– são também chamadas de fluorita,
porque este material entra na sua constituição, dando alguma correção para as
aberrações.
3.
Apocromáticas – possuem correção ampla. Abrangem todo o espectro.
4.
Planapocromática
– possui imersão, com aumento de 63 X
e abertura numérica de 1,4. Com ela se consegue o máximo de resolução de um
microscópio óptico.
Objetivas de imersão: são objetivas de maior aumento um que se utiliza óleo
de imersão para aproveitar toda a abertura numérica da lente. O óleo possui
índice de refração tal que impede que os raios luminosos sofram reflexão ao
passar do material para o ar contido entre a lamínula e a objetiva.
Condensador: é
formado por várias lentes internas. Tem por finalidade concentrar a de modo que
a objetiva receba um cone cheio de luz. É regulado pelo diafragma de abertura.
A iluminação é por
Transparência, sendo o objeto observado fino suficiente para a luz o
atravessar. Uma lâmpada ou espelho trazem a luz da parte inferior do
microscópio e esta atravessa o condensador, o material a ser observado e depois
a objetiva. Há microscópios que a luz provém do mesmo lado da objetiva.
Chama-se epi-iluminação.
A luz usada:
pode ser natural mas a mais comum é a de uma lâmpada com filamento de
tungstênio. Emite luz quase branca (levemente amarelada).
Para obter o máximo de resolução do microscópio basta
seguir a técnica de iluminação de Kohler. Como proceder?
1.
Fechar o diafragma de
abertura e focalizá-lo, mexendo no condensador. Aparecerá uma imagem facetada.
2.
Centralizar a imagem
acima.
3.
Abrir o diafragma de
abertura até iluminar uniformemente o campo.
1.
Campo claro
2.
Campo escuro
3.
Contraste de fase
4.
Contraste interferencial
5.
Polarização
6.
Fluorescência
7.
Microscópio invertido
8.
Microscópio
estereoscópico
9.
Confocal a laser
1. Campo claro: todo
os microscópios funcionam com campo claro. É utilizado para observação de
materiais corados, geralmente entre lâmina e lamínula.
2. Campo escuro:
são microscópios que utilizam condensadores especiais. A luz fica de tal modo
inclinada, que não penetra diretamente na objetiva. A luz atinge o material e
somente a porção desviada pelo objeto penetra na objetiva, formando a imagem. O
fundo fica claro e o material brilhante. Se não houver objeto o campo fica
totalmente escuro. Esta modalidade da microscopia é utilizada para material de
tamanho muito pequeno que sejam muito transparentes e apresentam pouco
contraste para serem observados em campo claro.
3. Contraste de fase: baseia-se nos princípios físicos da difração da luz. Este microscópio é
dotado de um sistema óptico especial que transforma diferenças de fase dos
raios luminosos em diferenças de intensidade. Assim, as diferenças de fase,
para as quais o olho não é sensível, tornam-se visíveis, pois são traduzidas em
diferenças de intensidade luminosa, facilmente perceptível. O microscópio de
contraste de fase pode ser usado de modo que as estruturas celulares apareçam
escuras (fase positiva) ou claras (fase negativa).
4. Contraste interferencial: é muito útil quando se trabalha com materiais
excessivamente espessos para contraste de fase ou quando se deseja visualizar
pequenos detalhes de células sem corar, cujo halo de contraste de fase esteja
provocando alterações na imagem.
5. Polarização:
é utilizado na observação de materiais que sejam birrefringentes (estruturas
anisotrópicas, com índices diferentes de refração como músculo, ossos,
celulose, fibras, cabelos, cristais, etc.). O microscópio de polarização possui
dois prismas: um polarizador e outro analisador. A luz ao penetrar em
estruturas como as citadas se desdobra em duas. O prisma deixa passar uma das
vibrações luminosas mas não a outra, de modo que as estruturas que forem
isotrópicas serão canceladas e no seu lugar ficará escuro. As estruturas birrefringentes
(anisotrópicas) produzirão um tipo de vibração luminosa que passará, ficando
brilhante. Somente as estruturas birrefringentes aparecerão brilhantes, ficando
o restante do material escuro.
6. Fluorescência: este
microscópio é semelhante com o convencional, exceto por apresentar um sistema
diferente de iluminação e jogos de filtro – um que filtra a luz antes da mesma
alcançar o material e outro que filtra a luz emitida pelo mesmo. O espécime a
ser estudado deve ser previamente marcado com algum composto fluorescente.
Somente a luz emitida pelo objeto é observada, ficando desse modo brilhante com
fundo negro. O microscópio óptico de fluorescência trabalha com sistema
epi-iluminação.
7. Microscópio invertido: permite a observação de material muito espesso,
impossível de visualizar nos demais microscópios. Permite que observe células
dentro dos tubos e garrafas, sem contudo, precisar abri-las evitando-se assim
problemas de contaminação.
8.
Microscópio
estereoscópico: possuem as oculares
(lupa) que ampliam o material permitindo observações de espécimens para
dissecções.
9.
Confocal laser: possui uma série de peculiaridades que prime observar
material espesso, sem corar, vivo ou não, pois focaliza diferentes planos
focais, obtendo-se cortes ópticos. Ele trabalha, geralmente, com o mesmo tipo
de sistema óptico usado pela florescência convencional, com a diferença que
neste, todo o campo fica iluminado enquanto que no LSM, o sistema óptico
focaliza somente um ponto em determinada profundidade no espécimen. Uma fonte
luminosa bastante forte e brilhante é requerida e desse modo usa-se o laser. A
luz do laser passa por um pequeno orifício e ilumina um único ponto do
espécimen. A fluorescência emitida pelo material é coletada e conduzida para um
detector, que possui um segundo orifício pequeno. Dessa forma a imagem final
que teremos é aquela captada pelo segundo orifício.
O limite de resolução corresponde à menor distância
entre dois pontos em que eles ainda podem ser distinguidos separadamente. Desse
modo, O poder de resolução do microscópio corresponde aos menores limites de
resolução possíveis. Assim,
d = K x l
N.A.
Onde K é uma constante (0,61), l é o comprimento de onda utilizado e N.A. é o número
de abertura da lente objetiva. Desse modo, ao utilizarmos um microscópio
devemos logo reparar o número de abertura de suas objetivas, pois o melhor
microscópio é aquele que vai apresentar o maior número de abertura pois seu limite de resolução será menor.
O poder de resolução é inversamente proporcional ao
limite de resolução. O melhor microscópio é aquele com maior poder de
resolução.
O limite de resolução do olho humano é em torno de 0,2
mm. O melhor microscópio óptico possui limite de resolução de 0,2 mm. Logo
quanto menor o comprimento de onda melhor a resolução.
MICROSCOPIA ELETRÔNICA
A relação
entre o limite de resolução e o comprimento de onda de uma radiação luminosa é
verdadeiro para qualquer forma de radiação , seja ela um feixe de luz ou de
elétrons. Com elétrons entretanto , o limite de resolução pode ser muito
pequeno. O comprimento de onda de um elétron diminui com o aumento da sua
velocidade. Em um microscópio eletrónico , com uma voltagem de aceleração de 100.000 V , o comprimento de onda de um
elétron é 0,004 nm .Teoricamente , a resolução de tal microscópio seria cerca
de 0,002 nm , que é 10.000 vezes maior do que a do microscópio ótico.
Entretanto , devido ao fato das aberrações de uma lente de elétrons serem mais
difíceis de se corrigir do que aquelas produzidas por uma lente de vidro, o poder de resolução da maioria dos mais
modernos microscópios eletrônicos é, nas melhores condições, 0,1 nm. Ainda
mais, problemas na preparação da amostra, contraste e danos causados pela
radiação limitam, efetivamente, a resolução normal para materiais biológicos
para 2 nm. Contudo, este valor é cerca de 100 vezes melhor do que a resolução
do microscópio óptico .
MICROSCOPIA
ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (TEM)
O
microscópio eletrônico de transmissão é semelhante ao microscópio óptico, a
pesar de muito maior e invertido. A fonte de iluminação é um filamento ou
cátodo que emite elétrons do topo de uma coluna cilíndrica de cerca de 2 metros
de altura. Sendo os elétrons espalhados através de colisão com as moléculas de
ar, primeiramente o ar tem que ser bombeado para fora da coluna para criar
vácuo. Os elétrons são então acelerados a partir do filamento por um ânodo e
atravessam um pequeno orifício formando um feixe de elétrons que desce pela
coluna. Bobinas magnéticas, colocadas ao longo da coluna, convergem o feixe de
elétrons assim como as lentes de vidro convergem a luz em um microscópio
óptico. A amostra é colocada no vácuo, através de uma câmara de compressão, na
trajetória do feixe de elétrons. Como para o microscópio óptico a amostra é
usualmente corada, neste caso, com material denso ao elétron, como veremos na
próxima seção. Alguns dos elétrons que atravessam a amostra são espalhados
pelas estruturas coradas com material denso aos elétrons o restante é
convergido para formar uma imagem de forma análoga ao processo de formação de
uma imagem no microscópio óptico em uma placa fotográfica ou em uma tela
fosforescente. Devido ao fato de os elétrons disperso se desviarem do feixe, as
regiões densas da amostra são destacadas como áreas de fluxo reduzido de
elétrons, as quais se mostram escuras.
COLORAÇÃO
NEGATIVA
Permitem a visualização de macromoléculas com auto
resolução. Apesar de macromoléculas isoladas, como DNA ou proteínas, de alta
massa molecular, podem ser prontamente analisadas ao microscópio eletrônico, se
elas forem sombreadas com metal para produzir contraste, detalhes mais
minuciosos podem ser vistos utilizando-se coloração negativa. As moléculas,
sustentadas por um filme delgado de carbono ( o qual é praticamente
transparente aos elétrons ), são lavadas com uma solução concentrada de sal
mais pesado com acetato de uranila. Após amostra secar, uma camada muito fina
do sal do metal cobre completamente o filme de carbono exceto no local onde
esta localizada a amostra. Devido ao fato das macromoléculas permitirem a
passagem dos elétrons, muito mais facilmente do que a coloração de metal pesado
circundante, uma imagem oposta ou negativa da molécula criada. Coloração negativa
é especialmente útil para observação de grandes agregados de macromoléculas,
como no caso dos vírus ou dos ribossomos e para visualização da estrutura da
sub unidade dos filamentos de proteína.
Sombreamento e coloração negativa são capazes de produzir uma visão de
superfície de alto contraste de pequenos agrupamentos de macromoléculas, mas
ambos são limitados em termos de resolução devido ao tamanho da menor partícula
do metal utilizado, tanto no caso do sombreamento quanto na coloração empregada.
MICORCÓPIO
ELETRÔNICO DE VARREDURA
FUNCIONAMENTO:
O SEM - Microscópio Eletrônico de Varredura - utiliza
os elétrons que são emitidos da superfície de amostra. A amostra a ser examinada é fixada,
desidratada e coberta com uma camada fina de metal pesado. A amostra é varrida por um feixe de
elétrons. O trajeto do feixe de
elétrons é, em seguida, modificado por um conjunto de bobinas refletoras que o
fazem percorrer o espécimen ponto a ponto e ao longo de linhas paralelas
(VARREDURA). Ao atingirem o espécimen,
os elétrons causam diversos efeitos.
Emitem elétrons secundários que são colhidos pelo coletor, passam por um
sistema de amplificação e são transformados em pontos de mais ou menos
luminosidade. As micrografias são
obtidas por fotografia da imagem na tela.
UTILIZAÇÃO:
Obter imagens tridimensionais de superfícies.
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE CRIOFRATURA
FUNCIONAMENTO:
As células são congeladas à temperatura do
nitrogênio líquido (-196°C) e depois fraturado com uma lâmina de bisturi. O corte do plano da fratura tenta mostrar o
interior da membrana celular.
UTILIZAÇÃO:
Possibilita uma forma de visualização do
lado interno das membranas celulares.
MICROSCOPIA CRIOELETRÔNICA
FUNCIONAMENTO:
Uma camada muito fina ( ~ 100 nm ) de uma
amostra hidratada rapidamente congelada.
Um prendedor de amostra e necessário para manter esta amostra hidratada
a -160°C no vácuo do
microscópio, onde esta pode ser observada diretamente, sem fixação, coloração
ou secagem.
UTILIZAÇÃO:
Visão de estruturas internas
tridimensionais de vírus por exemplo.
CONCLUSÃO
Os
conhecimentos sobre as células progridem à medida que as técnicas de
investigação se aperfeiçoam. O
aparecimento de um novo instrumento de trabalho, ou a aplicação mais engenhoso
de um aparelho já existente, leva sempre a novas descobertas e à elucidações de
algumas funções celulares. Muitas
técnicas de microscopia óptica estão disponíveis para a observação de
células. Células que foram fixadas e
coradas podem ser estudadas em um microscópio óptico convencional, enquanto
anticorpos acoplados a corantes fluorescentes podem ser usados para localizar
moléculas específicas nas células em um microscópio de fluorescência.
O microscópio confocal de varredura
proporciona secções ópticas finas, e pode ser usado para reconstruir uma imagem
tridimensional, células vivas podem ser observadas em contraste de fase,
contraste de interferência diferencial, ou óptica de campo escuro. Todas as formas de microscopia óptica são
facilitados por técnicas de processamento eletrônico de imagens, que ampliam e
retiram a imagem.
O
advento do microscópio eletrônico e seu emprego para estudos morfológicos e
citoquímicos representam enorme impulso para o conhecimento das funções
celulares, como na determinação da estrutura detalhada das membranas e
organelas na célula. Imagens tridimensionais
da superfície das células e tecidos podem ser obtidos por microscopia
eletrônica de varredura, enquanto o interior da membrana e células podem ser
visualizados por técnicas de criofraturas e criodecapação respectivamente.
A
influência do microscópio eletrônico foi tão grande que levou a uma revisão
completa nos conceitos morfológicos dos constituintes celulares. Atualmente, a forma e a estrutura das
organelas são geralmente descritos conforme aparecem no microscópio eletrônico.
O
emprego conjunto das técnicas modernas, incluindo a radioautografia, a cultura
de células em meios nutritivos definidos, o emprego da microscopia de
fluorescência, do microscópio eletrônico de varredura, das técnicas de
criofratura e das técnicas bioquímicas, veio ampliar de tal maneira o estudo da célula. Que se tornou usual
designar essa nova abordagem sob a Biologia Celular e Molecular através da
microscopia.
BIBLIOGRAFIA
Biologia Molecular da Célula,
3a. Edição, Editora Artes Médicas
CARNEIRO, Junqueira. Biologia
Celular e Molecular, 6a. Edição, Editora Guanabara